抗除草劑大豆356043 ERM-BF425d品系特異性定性和定量PCR體系的建立與評(píng)估
在過去的10年中，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)批準(zhǔn)用于全球性栽培和商業(yè)化。然而，隨著越來越多 的轉(zhuǎn)基因食品、食品配料和添加劑進(jìn)入市場(chǎng)和餐桌，社會(huì)上逐漸出現(xiàn)了爭(zhēng)議之聲，分別涉及食品安全、環(huán) 境風(fēng)險(xiǎn)和倫理等問題，這使得40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)頒布了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)法規(guī)，來保護(hù)消費(fèi)者的權(quán)益。大 豆是一種非常重要的轉(zhuǎn)基因作物。2007 年，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積已達(dá)到總大豆種植面積的一半以 上。抗除草劑大豆356043 是由基因槍轉(zhuǎn)化生成的，含有一段孤立的、包含一個(gè)改進(jìn)功能的草甘膦基因片段。這個(gè) 片段最初來自地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)和大豆(Blycine max L.)的改良原生合成酶基因。目前 只有少數(shù)出版物發(fā)表了關(guān)于抗除草劑大豆356043食品安全與毒理學(xué)的報(bào)道和一篇356043大豆的實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)，尚未見對(duì)其側(cè)翼序列和檢測(cè)方法優(yōu)化的報(bào)道。本研究通過反向PCR技術(shù)分離了356043大豆的側(cè) 翼序列，并建立了基于其左右側(cè)翼序列的品系特異性定性定量PCR檢測(cè)體系。
研究采用反向PCR分離側(cè)翼序列，經(jīng)過篩選采用限制性內(nèi)切酶BglⅡ消化，產(chǎn)物自連后通過兩組不 同引物擴(kuò)增分別連接至質(zhì)粒載體進(jìn)行側(cè)翼序列分析。品系特異定性實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過多輪巢式PCR引物擴(kuò) 增分別得到了：位于啟動(dòng)子和右側(cè)翼序列上的，擴(kuò)增長(zhǎng)度為127 bp的引物對(duì)R356043-F/R，以及位于終止 子和左側(cè)翼序列上的，擴(kuò)增長(zhǎng)度為109 bp的引物對(duì)L356043-F/R。兩者檢測(cè)限均達(dá)到0.05%(基因拷貝數(shù) 大約是42)。在Taqman實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中，分離獲得的左右側(cè)翼序列引物都得到了線性良好的標(biāo)準(zhǔn) 曲線和較高的PCR擴(kuò)增效率。
本研究建立的基于左右側(cè)翼序列的品系特異性定性和定量PCR體系，可用于抗除草劑大豆356043的精準(zhǔn)檢 測(cè)。通過獲得準(zhǔn)確的核酸片段信息，完善轉(zhuǎn)基因植物的分子特征庫(kù)，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)及 轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化體系的建立提供了關(guān)鍵基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。另外，此方法適用于其他側(cè)翼 序列未知的轉(zhuǎn)基因作物，為新轉(zhuǎn)基因作物品系特異性定性和定量PCR體系的建立與評(píng)估提供新的技術(shù) 手段。
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